| 腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAMe）是甲硫氨酸的活性形式,1951年為Cantoni所發(fā)現(xiàn),在生物體內(nèi) 由甲硫氨酸和ATP經(jīng)SAMe合成酶合成。SAMe是一種重要的生理活性物質,參與了生物體內(nèi)40多種生化反應, SAMe代謝異常將會導致肝臟疾病和各種精神混亂。正是于SAMe如此復雜地涉及到重要的生化反應,因此表現(xiàn) 出廣泛治療作用,對關節(jié)炎、抑郁癥和肝臟功能紊亂等均有較好地治療作用,而且還是預防癌癥、心血管疾病和抗衰老的保健藥物[1]。正是由于腺苷蛋氨酸廣泛的藥用價值,引起了國內(nèi)外眾多研究者的興趣。畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種的真核表達系統(tǒng),由于其具有強烈的好氧生長偏愛性[2],因此在對重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達腺苷蛋氨酸的研究中,本文重點研究了發(fā)酵液中溶解氧濃度對重組畢赤酵母表達產(chǎn)物的影響。 1 材料與方法 1·1材料 1·1·1菌株:重組畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌,由本公司保存。 1·1·2培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基[3]。 1·2方法 1·2·1測定方法:HPLC法測定發(fā)酵液中SAMe的含量[3];用溶氧電極（梅特勒-托利多儀器有限公司）測定發(fā)酵液中溶氧濃度。 1·2·2培養(yǎng)方法[3]:將保藏菌種接種到YPD平板培養(yǎng)基上,劃線培養(yǎng),置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑選生長良好的單菌落接種到YPD種子培養(yǎng)基中,在30℃,300rpm搖床中培養(yǎng)16~24h后,按照1%的接種量接入裝有10L培養(yǎng)基（10g·L-1酵母膏,10g·L-1蛋白棟,0·05M磷酸鉀緩沖液,13·4 g·L-1含有硫氨酸的酵母基本氮源,4×10-4g·L-1生物素,2 g·L-1甘油,20 g·L-1甲醇,7·5 g·L-1L-甲硫氨酸）的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵,控制pH值5·0。發(fā)酵約20h,待甘油耗盡后,繼續(xù)流加甘油培養(yǎng)基（50%,含L-甲硫氨酸10 g·L-1）約10h,當菌濕重達到200 g·L-1后,開始流加甲醇,誘導表達腺苷蛋氨酸。 1·2·3發(fā)酵液中溶氧控制方法:通過控制發(fā)酵過程中的通氣量、攪拌轉速、罐壓和輔助通入純氧等方法來控制發(fā)酵液中的溶解氧濃度。當發(fā)酵液中溶氧值低于目標值時,首先提高通氣量來改善發(fā)酵液中的溶氧情況;當采用提高通氣量不能有效改善發(fā)酵液中溶氧情況時,可適當提高攪拌轉速來控制;同理,依次采取提高罐壓和輔助通入純氧來控制發(fā)酵液中的溶氧濃度。 2 結果與討論 為了考察發(fā)酵液中不同溶氧濃度對重組畢赤酵母表達腺苷蛋氨酸的影響,我們設計了3組試驗,*組試驗,在整 個發(fā)酵過程中不控制發(fā)酵液中的溶氧;第二組試驗,控制發(fā)酵過程中的溶氧在30%左右;第三組,控制發(fā)酵過程中的溶氧在50%左右。試驗結果見表1。
在重組畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中,為了獲得高生物量和高濃度表達產(chǎn)物,通常投入幾倍于生物量的基質以滿足菌體迅速生長繁殖及大量表達基因產(chǎn)物的需要。由于發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質極為豐富,使得重組畢赤酵母菌株在接種并度生長延遲期,進入對數(shù)生長期后,菌株生長極為迅速,進而需要消耗大量的氧氣。因此,發(fā)酵液中的溶氧值迅速降低,當不采取任何措施改善溶氧條件時,發(fā)酵液中的溶氧濃度迅速降低到0,并一直持續(xù)到發(fā)酵結束。由于氧供給的嚴重不足,使得細胞的生長收到了限制,盡管溶氧低時生成的細胞膜中不飽和脂肪的含量高,流動性大,易于吸收甲硫氨酸,但是由于細胞的生長受到限制,不能大量供給ATP,因此zui終影響了產(chǎn)物的高濃度表達,使得zui終SAMe的產(chǎn)量很低,僅僅0·5 g·L-1;此時氧供給便成了細胞生長和產(chǎn)物表達的限制因素。 |
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